mRNA的特異性遞送是質(zhì)粒DNA的絕佳替代品，因為后者具有隨機(jī)整合到宿主基因組中的潛在風(fēng)險。隨著mRNA修飾技術(shù)和遞送技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用前景越來越廣闊。

一、 感染性疾病

mRNA疫苗可以同時激活細(xì)胞和體液免疫兩種機(jī)制，達(dá)到高保護(hù)率。mRNA疫苗的研究對象是具有強(qiáng)傳染性和高危害性的RNA病毒，如嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征（SARS-CoV-2）、甲型流感病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、寨卡病毒（Zika）、人類免疫缺陷病毒（HIV-1）、埃博拉病毒（EBOV）等。

1.1 新冠疫苗

近幾十年來，mRNA疫苗的發(fā)展和技術(shù)突破，為它在SARS-CoV-2大流行期間的迅速崛起奠定了基礎(chǔ)。SARS-CoV-2是一種新型的β-冠狀病毒。SARS-CoV-2在其（+）RNA基因組中至少編碼29種蛋白質(zhì)，其中四種是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)：刺突（S），膜（M），包膜（E）和核衣殼（N）蛋白。SARS-Cov-2病毒體主要由膜（M）蛋白和包膜（E）蛋白組成的包膜，內(nèi)部包載單鏈陽性RNA病毒以及核衣殼（N）蛋白。表面的刺突（S）蛋白負(fù)責(zé)感染宿主細(xì)胞，這也是中和抗體的主要位點，容易發(fā)生突變，而mRNA疫苗可以通過根據(jù)突變菌株的突變基因更新其序列來快速應(yīng)用。治療性mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，可被翻譯成S蛋白，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。同時，mRNA疫苗還利用人體自身的分子機(jī)制，體內(nèi)制造抗原縮短了免疫反應(yīng)時間。

圖1.COVID-19病毒樣貌圖

圖2.mRNA疫苗作用機(jī)制

COVID-19在世界范圍內(nèi)造成了一場充滿挑戰(zhàn)和威脅性的大流行，造成了巨大的健康和經(jīng)濟(jì)損失。FDA已授予BNT162b2（輝瑞/BioNTech）和mRNA-1273（Moderna）的緊急使用授權(quán)。它們都是由LNP包裹編碼S蛋白的mRNA制備而來。BNT162b2已被推薦用于16歲及以上的人，劑量為30μg，在預(yù)防SARS-COV-2感染方面有效率為95%。mRNA-1273則被推薦給18歲及以上的人，劑量為100μg，預(yù)防SARS-CoV2感染方面有效率為94.5%。然而，兩種疫苗均報告了一些相關(guān)的過敏癥狀，包括注射部位的疼痛、發(fā)紅、發(fā)熱、疲勞、頭痛和肌肉疼痛。據(jù)報道，與mRNA-1273相比，BNT162b2的不良反應(yīng)發(fā)生率較低；然而，mRNA-1273在運(yùn)輸和儲存方面更穩(wěn)定。

圖3.兩款mRNA疫苗研發(fā)時間線

1.2 流感疫苗

Martinon課題組證明了通過對動物進(jìn)行皮下注射mRNA脂質(zhì)體疫苗，可以在動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞滅殺流感病毒。流感疫苗是第一個嘗試使用mRNA技術(shù)進(jìn)行預(yù)防疾病的疫苗。

Petsch課題組設(shè)計了多價mRNA疫苗，在動物體內(nèi)評估了疫苗預(yù)防甲型流感（H1N1），H3N2和H5N1病毒的作用。這種皮內(nèi)注射的mRNA疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性中和抗體，并保護(hù)動物免受甲型流感病毒的侵害。

除此以外，Moderna通過肌內(nèi)注射針對甲型禽流感病毒H10N8和H7N9的mRNA疫苗已被證明是安全和有效的。

1.3 狂犬病疫苗

mRNA疫苗的保護(hù)作用已被證明在呼吸道病原體之外依舊是有用的。目前CureVac已經(jīng)在其狂犬病疫苗候選產(chǎn)品CV7202的I期試驗中，評估了該疫苗的安全性，反應(yīng)性和免疫反應(yīng)。值得一提的是，起初CureVac的一代狂犬病疫苗CV7201采用的遞送載體是魚精蛋白，但是由于其轉(zhuǎn)染效率并不是很好，所以二代苗改為使用LNP進(jìn)行遞送。

Lou課題組則發(fā)現(xiàn)，使用LNP遞送自編碼狂犬病病毒糖蛋白（RVG）的擴(kuò)增mRNA可以對狂犬病病毒起到一個良好的保護(hù)作用。他們比較了幾種常用的陽離子脂質(zhì)，然后選擇了DOTAP以及DDA，它們在誘導(dǎo)抗原表達(dá)方面最有效，后續(xù)將使用動物實驗進(jìn)一步評估由它們形成的LNP-mRNA的疫苗效果。

1.4 Zika病毒疫苗

Pardi課題組提出了一種二價mRNA疫苗，該疫苗使用的是在2013年爆發(fā)中編碼寨卡病毒株的前葉和包膜糖蛋白的mRNA。單劑疫苗，封裝在LNP中并通過皮內(nèi)遞送，疫苗接種后兩周至五個月內(nèi)，可以保護(hù)小鼠免受病毒的攻擊。

Moderna也使用了相同的抗原，通過包封未修飾mRNA開發(fā)了一種針對寨卡病毒的疫苗-mRNA-1893疫苗，該疫苗獲得了FDA的快速批準(zhǔn)，并正在進(jìn)行I期試驗，以評估其安全性、耐受性和免疫原性。研究也證實：mRNA-1893可以在感染的小鼠模型成功阻止病毒的傳播。

1.5 CMV疫苗

John課題組設(shè)計了一種巨細(xì)胞病毒（CMV）疫苗，用于預(yù)防懷孕期間和移植患者的CMV感染。該疫苗由六種編碼CMV糖蛋白和五聚體復(fù)合物，經(jīng)過修飾的mRNA組成，并以LNP的形式肌內(nèi)注射。單劑量注射后，在小鼠和非人靈長類動物中引起了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，目前正處于由Moderna（mRNA-1647）贊助的臨床試驗中。

1.6 基孔肯雅熱疫苗

除了增強(qiáng)主動免疫外，mRNA還可用于被動免疫。Moderna的候選藥物mRNA-1944旨在提供針對基孔肯雅熱病毒的被動保護(hù)。從自然感染幸存者的B細(xì)胞中分離出超強(qiáng)效抗體，其序列被編碼成mRNA分子，封裝在LNP中，并通過輸注遞送進(jìn)小鼠體內(nèi)。在基孔肯雅熱小鼠模型中遞送mRNA-1944后，評估其保護(hù)能力。對非人靈長類動物的進(jìn)一步研究也表明，mRNA-1944具有持久的免疫原性作用。

1.7 新生兒皰疹

Latourette II課題組選擇在交配前的雌性小鼠進(jìn)行免疫來評估m(xù)RNA-LNP和蛋白質(zhì)疫苗對新生兒皰疹的保護(hù)作用，然后比較了母體和幼鼠中的中和抗體水平。這兩種疫苗都保護(hù)了第一胎和第二胎免受播散性感染，并被證明可有效預(yù)防新生兒皰疹。

二、 腫瘤

mRNA腫瘤疫苗的目的是強(qiáng)化細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，例如典型的T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，從而達(dá)到在不傷害正常細(xì)胞的情況下，去除或減少腫瘤細(xì)胞的目的。STING被認(rèn)為是先天免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)因子的中心。當(dāng)受到刺激時，STING會誘導(dǎo)I型干擾素。細(xì)胞因子和T細(xì)胞募集因子的表達(dá)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的天然效應(yīng)細(xì)胞樹突狀細(xì)胞（如NK）和腫瘤特異性T細(xì)胞，它們不僅可以在體內(nèi)表達(dá)抗原，還可以激活STING信號通路，并顯著增強(qiáng)腫瘤抗原特異性免疫應(yīng)答。這也意味著mRNA疫苗可以與其他腫瘤學(xué)療法（如檢查點抑制劑和免疫激動劑）聯(lián)合使用，以實現(xiàn)更全面的腫瘤學(xué)治療效果。

Moderna，BioNtech和CureVac是致力于mRNA技術(shù)的三巨頭，在mRNA腫瘤疫苗上投入了大量資金。幾種mRNA腫瘤疫苗目前正在臨床試驗中。

mRNA-5671靶向KRAS，目前正在NSCLC，結(jié)直腸癌以及胰腺癌中，具有晚期或轉(zhuǎn)移性KRAS突變的患者中進(jìn)行評估。

mRNA-4157是Moderna的另一種癌癥疫苗，但與mRNA-5671不同，它是黑色素瘤的個體化治療疫苗。在這種方法中，對患者的腫瘤進(jìn)行基因測序和生物信息學(xué)分析，以鑒定20個患者特異性新抗原表位，這些表位由為個體患者制造的mRNA結(jié)構(gòu)編碼。

BNT122（II期）旨在治療局部晚期或轉(zhuǎn)移性實體瘤，包括黑色素瘤，非小細(xì)胞肺癌和膀胱癌。BioNtech還有許多其他抗腫瘤疫苗正在開發(fā)中，例如用于晚期黑色素瘤的BNT111，BNT112用于治療針對前列腺癌，BNT114用于三陰性乳腺癌，BNT115用于卵巢癌等。BNT113是抗HPV16衍生的癌蛋白E6和E7，它們存在于HPV16陽性的實體癌中，例如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。

表1. mRNA三巨頭的腫瘤候選疫苗研發(fā)

除上表中的疫苗情況，陽離子脂質(zhì)體在mRNA腫瘤疫苗中得到了廣泛的研究，尤其是已在多種腫瘤中進(jìn)行了臨床前研究。

表2.用于腫瘤候選疫苗中的脂質(zhì)

mRNA疫苗將一些外源性基因表達(dá)產(chǎn)物直接作用于免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫細(xì)胞的生長和增殖。因此可以通過增強(qiáng)T細(xì)胞的抗原反應(yīng)來增強(qiáng)宿主的抗病毒和抗腫瘤作用。

三、 心血管疾病

越來越多的研究表明，RNA在靶向以前參與心血管疾病發(fā)展和進(jìn)展的途徑方面具有很高的實用性。盡管在治療方案方面取得了重大進(jìn)展，但心血管疾病仍然是世界頭號死因。

Mipomersen是最早治療心血管疾病的核酸療法之一，它是一種寡核酸（ASO）藥物，靶向編碼載脂蛋白B-100的mRNA。經(jīng)過化學(xué)修飾的ASO可以減少其毒性。在最近一項ASO針對脂蛋白mRNA的II期試驗中，超過90%的患者在每周注射20mg或每4周注射60mg后，脂蛋白（a）的濃度低于50mg/dl。

另一個已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗的ASO是volanesorsen。該ASO可以皮下注射，并通過結(jié)合APOC3 mRNA并促進(jìn)其降解來發(fā)揮作用。在一項II期研究中，Volanesorsen降低了Apoc-II（-80%）和甘油三酯（-71%），HDL-膽固醇水平升高（46%）。降低膽固醇的另一種方法是靶向編碼酶前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/酮（PCSK9）的mRNA，該酶主要在肝臟中產(chǎn)生。

除了抑制內(nèi)源性mRNA的藥物外，第一種進(jìn)入臨床試驗的心血管相關(guān)mRNA藥物是Moderna設(shè)計研發(fā)的編碼血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-A的mRNA。在一項I期研究中，皮內(nèi)注射VEGF-A mRNA可導(dǎo)致2型糖尿病患者局部VEGF-A蛋白表達(dá)增加（經(jīng)皮膚微透析評估）和皮膚血流量增加。根據(jù)這些結(jié)果，一項2a期臨床試驗將確定該mRNA治療藥物是否能恢復(fù)冠狀動脈疾病患者缺血但可行的心肌區(qū)域，如射血分?jǐn)?shù)評估。這是一項隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照、多中心研究，針對接受冠狀動脈搭橋手術(shù)的中度收縮功能受損患者。通過心外膜注射將患者隨機(jī)分配到枸櫞酸鹽緩沖液中的0mg，3mg或30mg VEGF-A mRNA劑量。如果這項計劃工作成功，它將提供證據(jù)，證明將mRNA直接注射到缺血組織中可以改善灌注和功能。

圖3.moderna與阿斯利康合作共研的心肌缺血藥物

四、 其他疾病

4.1 遺傳性疾病

Patel課題組使用了微流控技術(shù)制備了11個脂質(zhì)納米顆粒，并測試了它們將mRNA遞送到眼球后部的能力。研究表明，含有低pKa和不飽和脂質(zhì)鏈的LNP，在視網(wǎng)膜中具有最多的基因轉(zhuǎn)染劑量，并且基因表達(dá)動力學(xué)顯示，mRNA快速啟動（在4小時內(nèi)）并且可以持續(xù)96小時。眼部的基因遞送具有細(xì)胞類型特異性，在視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）中表達(dá)最多，在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)有限，實驗也表明，通過LNP遞送mRNA可用于治療RPE的單基因視網(wǎng)膜退行性疾病并預(yù)防失明。

4.2 免疫系統(tǒng)不成熟

Riley課題組研究了在子宮內(nèi)使用LNP來克服由于胎兒體積小而導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)不成熟。他們開發(fā)了一個LNP庫，用于將mRNA遞送到子宮內(nèi)的小鼠胎兒。利用LNP遞送熒光素酶mRNA進(jìn)行了篩選，并且與具有更高效率和安全性的基準(zhǔn)遞送系統(tǒng)相比，LNP可以在胎兒肝臟，肺和腸道中積累，表明LNP可以遞送mRNA以誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生治療性分泌蛋白。

4.3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

Dhaliwal課題組開發(fā)了一種基于mRNA療法的陽離子脂質(zhì)體，用于治療慢性疾病，其中脂質(zhì)體由DOTAP，DPPC和膽固醇組成。評估了小鼠模型中，鼻內(nèi)傳遞到大腦的潛力。結(jié)果證明了特異性非病毒mRNA遞送至腦部并治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的可行性

4.4 推進(jìn)iPSC技術(shù)

安全誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的生產(chǎn)為再生療法的發(fā)展帶來了巨大的希望。Choi課題組利用GO-PEI復(fù)合物將mRNA高效遞送到脂肪組織衍生的成纖維細(xì)胞中，并成功開發(fā)了一種基于RNA的簡單iPSC生產(chǎn)技術(shù)。研究證實：基于GO-PEI遞送mRNA的iPSC生產(chǎn)技術(shù)可用于制備臨床安全且經(jīng)濟(jì)上可行的iPSC，從而推動iPSC技術(shù)向臨床環(huán)境的轉(zhuǎn)化。

4.5 體內(nèi)CAR-T細(xì)胞編輯

CAR-T療法就是嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，英文全稱Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy。這是一種治療腫瘤的新型精準(zhǔn)靶向療法，近幾年通過優(yōu)化改良在臨床腫瘤治療上取得很好的效果，是一種非常有前景的，能夠精準(zhǔn)、快速、高效，且有可能治愈癌癥的新型腫瘤免疫治療方法。

2022年1月7日，Science期刊封面文章形式刊登了賓夕法尼亞大學(xué)研究者的最新研究，利用LNP為媒介靶向T細(xì)胞遞送mRNA，直接在體內(nèi)構(gòu)建CAR-T治療小鼠心衰癥狀。

研究者將編碼表達(dá)FAP CAR的mRNA通過LNP包裹并經(jīng)CD5抗體介導(dǎo)靶向遞送至T細(xì)胞。CD5介導(dǎo)內(nèi)吞到T細(xì)胞后，mRNA釋放并在T細(xì)胞膜表達(dá)FAP CAR，從而完成體內(nèi)構(gòu)建CAR-T的過程。mRNA注射至小鼠體內(nèi)后，隨后mRNA分子被T細(xì)胞捕獲，使得T細(xì)胞獲得特異性靶向攻擊心肌成纖維細(xì)胞的能力。mRNA成功重編碼心衰小鼠的T細(xì)胞，導(dǎo)致心臟纖維化明顯減少，心臟的大小與功能也修復(fù)至接近正常的狀態(tài)。這種方式有效改善了心衰小鼠模型的心臟功能。

圖4. LNP遞送mRNA實現(xiàn)CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)生成

五、 展望

合成的mRNA在遞送到細(xì)胞質(zhì)后經(jīng)歷瞬時蛋白表達(dá)，可以通過生理代謝途徑完全降解，這可以避免基因組整合的風(fēng)險。這種瞬態(tài)特征滿足了許多僅需要蛋白質(zhì)表達(dá)有限時間的應(yīng)用的需求，例如基因編輯，細(xì)胞重編程和一些免疫療法。不同的mRNA遞送系統(tǒng)具有不同的遞送機(jī)制。以脂質(zhì)納米遞送系統(tǒng)為例，LNPs通過微流體制備方法將mRNA捕獲在核心中，并且主要通過內(nèi)吞作用，溶酶體逃逸途徑遞送到細(xì)胞中。除脂質(zhì)納米遞送系統(tǒng)外，其他納米遞送系統(tǒng)還具有自己的mRNA包埋策略和遞送特征，如聚合物復(fù)合物、膠束、陽離子肽等。然而，基于合成mRNA的療法也存在一些缺點，例如遞送效率低下和不穩(wěn)定等問題。目前，受納米遞送系統(tǒng)有限的內(nèi)體逃逸的阻礙，只有少量的mRNA（0.01%）可以成功進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并表達(dá)蛋白質(zhì)，當(dāng)然隨著自復(fù)制mRNA的引用，劑量問題勢必得到改善。同時，在不久的將來，凍干或其他藥物處理方法可能有助于解決這些問題，甚至能夠進(jìn)行鼻腔、口服或呼吸給藥。mRNA納米遞送系統(tǒng)的給藥途徑對于確定mRNA疫苗在體內(nèi)的代謝和靶抗原蛋白的翻譯效率非常重要。目前，mRNA疫苗是系統(tǒng)的或局部施用的，這取決于需要表達(dá)抗原蛋白的位置。預(yù)防性疫苗通常局部皮下和肌肉注射以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而治療性mRNA疫苗通常腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥。此外，創(chuàng)新的多功能材料可能是應(yīng)對mRNA應(yīng)用挑戰(zhàn)的另一種解決方案。

綜上所述，COVID-19大流行將mRNA技術(shù)推向了世界，在關(guān)鍵時刻顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢。這些技術(shù)是經(jīng)過學(xué)術(shù)界和工業(yè)界科學(xué)家多年艱苦努力而開發(fā)的。雖然并不完美，但不可否認(rèn)的是，mRNA療法已經(jīng)準(zhǔn)備好迎接它的閃耀時代，并向全面工業(yè)革命的過渡。

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[1]. Li M, Li Y, Li S, Jia L, Wang H, Li M, Deng J, Zhu A, Ma L, Li W, Yu P, Zhu T. The nano delivery systems and applications of mRNA. Eur J Med Chem. 2022 Jan 5;227:113910. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113910. Epub 2021 Oct 8. PMID: 34689071; PMCID: PMC8497955.