表1.1 基于DLin-DMA的結(jié)構(gòu)設(shè)計

圖1.1. 新型陽離子脂質(zhì)的體內(nèi)評價

（a）. DLinDAP的沉默活性(▼), DLinDMA(▲), DLin-K-DMA(■) 和DLin KC2-DMA（●）在小鼠FVII模型中的篩選。所有LNP siRNA系統(tǒng)都是使用預(yù)成型囊泡（PFV）方法制備的，由可電離的陽離子脂質(zhì)、DSPC、膽固醇和PEG脂質(zhì)（40:10:40:10mol/mol）組成，F(xiàn)VII siRNA/總脂質(zhì)的比例約為0.05（wt/wt）。

（b）. 頭群擴展對DLin-K-DMA活性的影響。DLin-K-DMA（■）在DMA頭基和縮酮環(huán)連接體之間添加了額外的亞甲基，以生成DLin-KC2-DMA（●），DLin-KC3-DMA（▲）和DLin-KC4-DMA（▼）在小鼠因子VII模型中評估每種脂質(zhì)的制劑活性。

表1.2 含有新型脂質(zhì)的LNPs的生物物理參數(shù)和體內(nèi)活性

鑒于正電荷在指導(dǎo)脂質(zhì)設(shè)計的作用機制假說中的重要性，在DLin-K-DMA作為新的基準脂質(zhì)的綜述中研究了胺基頭基結(jié)構(gòu)變化的影響。進行了一系列頭基修飾、表征和測試，以探索大小、酸離解常數(shù)和可電離基團數(shù)量的影響（補充合成2和補充表2）。所測試的哌嗪基、嗎啉基、三甲基氨基或雙二甲基氨基修飾并不優(yōu)于DLin-K-DMA的基準二甲基氨基頭基。作為附加參數(shù)，通過引入額外的亞甲基來改變二甲基氨基和二氧戊環(huán)連接體之間的距離。該距離可以影響胺頭基的pKa以及電荷呈現(xiàn)相對于脂質(zhì)雙層界面的距離和柔性。相對于DLin-K-DMA，將單個額外的亞甲基插入頭部基團（DLin-KC2-DMA）產(chǎn)生效力的**增加。在FVII模型中，這種脂質(zhì)的ED50約為0.1 mg/kg，使其效力比DLin-K-DMA高4倍，比DLinDMA基準高10倍。然而，具有額外亞甲基的系鏈的進一步延伸**降低了活性，DLin-KC3-DMA的ED50約為0.6 mg/kg，DLin-KC4-DMA的ED50>3 mg/kg。

圖1.2. 基于DLin-K-DMA，延長頭部基團碳鏈長度對粒徑及ED50的影響

圖1.3. KC2-SNALP對嚙齒類動物和非人類靈長類動物的療效

（a） 相對于在小鼠中測試的初始篩選制劑，KC2-SNALP的療效得到改善。KC2-SNALP的體內(nèi)療效(○) 與小鼠因子VII模型中未優(yōu)化的DLin-KC2-DMA篩選（即PFV）制劑（●）的結(jié)果進行比較。數(shù)據(jù)點以PBS對照動物的百分比表示，**組平均值（n=5）±s.d.（b）KC2-SNALP在非人靈長類動物中的療效。食蟹猴（每組n=3）接受0.03、0.1、0.3或1 mg/kg siTTR，或1 mg/kg在KC2-SNALP或PBS中配制的siApoB的總劑量，通過頭靜脈靜脈輸注15分鐘（5 ml/kg）。給藥后48小時對動物實施安樂死。在肝臟樣品中測定TTR mRNA水平相對于***DH mRNA水平。數(shù)據(jù)點**組平均值±s.d.*，P<0.05；**，P＜0.005。

表1.3 含有KC2的SNALP的體內(nèi)活性

總結(jié)，研究人員將一種合理的方法應(yīng)用于新型陽離子脂質(zhì)的設(shè)計，這些脂質(zhì)被篩選用于基于LNP的siRNA遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)結(jié)構(gòu)分為三個主要功能元件：烷基鏈、連接基和頭基。以DLinDMA為起點，通過保持其他兩個元素不變，以系統(tǒng)的方式研究了這些元素中每一個的影響。首先，建立了烷基鏈，然后改變了連接體，**，探索了不同的頭基結(jié)構(gòu)。使用這種方法，描述了可離子化陽離子脂質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)-活性考慮因素，并鑒定了相對于DLinDMA基準具有改進活性的脂質(zhì)。性能**的脂質(zhì)（DLin-KC2-DMA）的SNALP制劑在嚙齒類和非人類靈長類動物中都具有良好的耐受性，并且在嚙齒類動物中在低至0.01mg/kg的siRNA劑量下表現(xiàn)出體內(nèi)活性，并且在非人類靈長目動物中表現(xiàn)出****基因（TTR）的沉默。盡管目前的工作范圍**于體內(nèi)肝臟遞送，但與之前關(guān)于LNP siRNA介導(dǎo)的非人靈長類動物沉默的報道相比，這項工作中實現(xiàn)的TTR沉默（ED50～0.3 mg/kg）**了活性的**提高。

圖2.1.TNS熒光法測定pKa

如圖2所示，四種可電離陽離子脂質(zhì)的pKa的測定實例。pKa的取值，定義為在一半**熒光強度下的pH值。(A). 14，pKa=4.17；(B). 52，pKa=5.73；(C). 19，pKa=6.95；(D). 48，pKa=8.12。

圖2.2. 小鼠體內(nèi)肝臟基因沉默活性與pKa的關(guān)系圖

將56個可電離陽離子脂質(zhì)配制成LNP，并進行ED50分析，根據(jù)它們的pKa，繪制得到圖4。有15種脂質(zhì)，沒有達到ED50劑量。剩余的脂質(zhì)，通過**擬合曲線突出顯示了**活性的化合物，其表現(xiàn)出在6.2和6.5之間的**pKa。

表2.1. 56種可電離陽離子脂質(zhì)的設(shè)計及其ED50，pKa值考察

圖2.3. 小鼠肝臟基因沉默活性圖

pKa在4-8.5之間，計算質(zhì)子化/未質(zhì)子化可電離陽離子脂質(zhì)的電離程度（%摩爾分數(shù)）。每個FVII ED50數(shù)據(jù)點（藍色）來源于四劑量反應(yīng)（每個劑量水平n=4只小鼠）。假設(shè)pH為7.4，在血液中攜帶正電荷的陽離子脂質(zhì)顯示為紅色，而在pH為5.5的酸性內(nèi)涵體中不帶電的陽離子脂質(zhì)的顯示為綠色

圖2.4.支持pKa值作為決定可電離陽離子脂質(zhì)，體內(nèi)肝臟基因沉默活性的主導(dǎo)因素。

可電離陽離子脂質(zhì)15、16和17的混合物使所得LNP的平均表面pKa值在5.64和6.93之間遞增移位。括號中的數(shù)字表示混合物中陽離子脂質(zhì)的摩爾比（氨基脂質(zhì)組分）。

圖2.5.可電離陽離子脂質(zhì)（16，DLin-MC3-DMA）的siRNA-LNP在小鼠和非人類靈長類動物中的功效。

在本研究中使用了含有50摩爾%的16（DLin-MC3-DMA）的經(jīng)過優(yōu)化后的制劑組合。相對于具有約0.005 mg.kg-1的中值有效siRNA劑量（ED50）的生理鹽水對照組，小鼠血清中的殘余FVII活性；柱狀圖**平均值（n＝5）給予食蟹猴0.03、0.1和0.3mg.kg-1劑量的靶向TTR基因的siRNA。線型圖則表示平均值（n=3），以TTR mRNA表示，相對于肝臟樣本中測定的***DH mRNA水平，ED50估計為<0.03 mg.kg-1。

Reference

[1]. Semple SC, Akinc A, Chen J, Sandhu AP, Mui BL, Cho CK, Sah DW, Stebbing D, Crosley EJ, Yaworski E, Hafez IM, Dorkin JR, Qin J, Lam K, Rajeev KG, Wong KF, Jeffs LB, Nechev L, Eisenhardt ML, Jayaraman M, Kazem M, Maier MA, Srinivasulu M, Weinstein MJ, Chen Q, Alvarez R, Barros SA, De S, Klimuk SK, Borland T, Kosovrasti V, Cantley WL, Tam YK, Manoharan M, Ciufolini MA, Tracy MA, de Fougerolles A, MacLachlan I, Cullis PR, Madden TD, Hope MJ. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):172-6. doi: 10.1038/nbt.1602. Epub 2010 Jan 17. PMID: 20081866.

[2]. Jayaraman M, Ansell SM, Mui BL, Tam YK, Chen J, Du X, Butler D, Eltepu L, Matsuda S, Narayanannair JK, Rajeev KG, Hafez IM, Akinc A, Maier MA, Tracy MA, Cullis PR, Madden TD, Manoharan M, Hope MJ. Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo. Angew Chem Int Ed Engl. 2012 Aug 20;51(34):8529-33. doi: 10.1002/anie.201203263. Epub 2012 Jul 10. PMID: 22782619; PMCID: PMC3470698.