乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染可導致慢性乙型肝炎（CHB）、肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌（HCC）。據世衛組織統計，2022年約有2.54億人感染慢性乙肝，新增120萬感染病例。此外，2022年乙肝導致約110萬人死亡，主要緣于肝硬化和肝細胞癌（原發性肝癌）。HBV是嚴重危害人類健康的公共衛生問題，但目前可選擇的治療方案十分有限。

HBV基因組是一個松弛環狀DNA（rcDNA），包含4個重疊的開放閱讀框，分別為S、C、P和X（圖1），進入宿主細胞核會被內源性酶修復成共價閉合環狀DNA（cccDNA），cccDNA編碼核心抗原（HBcAg）、表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和X蛋白（HBx）4個重疊的開放閱讀框（ORFs），也是HBeAg陽性患者HBsAg的主要來源。此外，不能復制的HBV線性片段可以整合到宿主基因組中（intHBV），整合HBV DNA是HBeAg陰性患者HBsAg的主要來源。CHB患者理想的治療終點是HBsAg持續陰性和/或抗HBs陽性，但由于完全清除cccDNA和整合HBV DNA是無法實現，因此CHB的治療目標是在有限療程內的持續治療實現HBsAg血清的清除。

圖1 HBV RNAs的結構和siRNA候選位置

RNA干擾（RNAi）技術可以通過誘導抗原抑制、減輕病毒血癥和沉默cccDNA來實現HBV的功能性治愈，因此這一技術在治療遺傳疾病和病毒感染方面顯示出巨大的應用前景。然而，考慮到HBV的10種不同基因型（A到J）之間有較高的遺傳多樣性，設計針對HBV的功能性siRNA具有很大的挑戰性。

隨著針對 COVID-19 的mRNA疫苗的成功以及多種 RNAi藥物的批準，RNA 醫學時代已成為現實。大量的研究集中在開發遞送系統，如脂質納米顆粒（LNPs）、與N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的化學綴合等，以增強 RNAi 療法的不良細胞攝取和不足的藥代動力學特性，從而提高其功效和安全性。然而，目前的RNAi治療大多僅限于肝臟疾病，受到肝臟靶向的嚴重限制。因此，RNAi治療靶向肝外組織并最終擴展其治療各種疑難雜癥，存在巨大的未滿足的醫療需求。

綜上，迫切需要設計廣泛針對HBV多種基因型并同時抑制HBsAg表達和cccDNA轉錄的siRNA以及開發安全高效的遞送系統，以提高乙肝病毒感染治療效果。

脂質納米顆粒（LNPs）通常可電離的陽離子脂質、膽固醇、聚乙二醇化脂質（PEG lipids）和輔助脂質組成。該課題組前期研究發現，羥基-PEG化LNPs可顯著降低與人體血液中存在的抗PEG抗體的吸附及其后續補體激活，抗原性較甲氧基-PEG化LNPs更弱，一定程度上避免產生PEG特異性抗體，使LNPs逃逸抗體識別和快速清除。

RNAi和抗體介導的HBsAg清除可以通過降低HBV病毒負荷來消除免疫功能障礙，但無法激活病毒特異性T細胞來實現對病毒的長期控制。有研究表明，IL-2是實現病毒抗原呈遞以及特異性CD4+和CD8+T細胞的激活和分化的關鍵調控因子。低劑量IL-2與IFN-α的序貫給藥可增加HBV患者體內特異性CD8+T細胞反應的頻率并恢復其功能。研究團隊認為，通過RNAi療法來抑制HBV病毒載量，同時使用IL-2來增強宿主免疫，可能足以打破免疫耐受，重建抗病毒免疫。

基于以上背景及發現，復旦大學袁正宏、占昌友及上海交通大學付煒等研究團隊在 《Signal Transduction and Targeted Therapy 》上發表了題為“Optimized RNA interference therapeutics combined with interleukin-2 mRNA for treating hepatitis B virus infection ”的創新性研究成果。該團隊篩選并修飾了一種針對HBV全基因型和全靶點的多功能siRNA組合藥物（siHBV），使用自主開發的新型脂質納米粒遞送系統（tLNP）實現其在動物體內高效安全的肝靶向輸送（tLNP/siHBV）。此外，該研究開發了一種治療HBV的聯合療法，使用tLNP共載siHBV與IL-2 mRNA（tLNP/siHBVIL2）。以上成果為推動HBV感染治療領域發展提供了新的策略。

功能性siRNA的設計、篩選和體外評價

研究團隊對HBV基因組進行了測序分析， 設計并篩選可針對HBV高保守序列、同時高效抑制HBsAg、整合HBV DNA和HBx的一系列siRNA。在兩種HBV相關細胞模型中評價序列及序列組合功效，并對其生物活性、細胞毒性和血清穩定性進行了檢測，最終篩選得到優選的序列組合（si-1260和si-1848的組合，簡稱“siHBV”）。siHBV具有廣泛的基因型覆蓋率（98.55%）和靶點覆蓋率（所有cccDNA及intHBV來源的HBV RNA）、較低的脫靶效應和細胞毒性，為HBV治療提供了一種具有顯著優勢的新siRNA候選藥物。

新型脂質納米粒遞送系統（tLNP）

配方的篩選和評價

研究團隊基于前期發現，使用新型脂質納米粒遞送系統（tLNP）：對PEG脂質進行羥基修飾的同時，進一步優化了其在LNPs配方中的摩爾比。具體如下：對含不同端基（甲氧基OMe/羥基OH-PEG）/比例（1.5%/3%）PEG脂質的LNP進行體內性能的研究，以靶向肝細胞的特異性低密度脂蛋白(LDL)載脂蛋白B（ApoB）的siRNA（siApoB）為模式siRNA，評價包封siRNA LNP的遞送性能。最終篩選得到的脂質處方：SM-102:DSPC:HO-PEG2000-DMG: CHOL =50:10:3:38.5，mol/ mol。

（mRNA-1273脂質處方：SM-102:DSPC:DMG-PEG2000: CHOL =50:10:1.5:38.5，mol/mol）

文中脂質輔料均購自艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司。

圖3 基于LNP的siRNA遞送系統的優化

siHBV和mIL-2 mRNA共遞送系統（tLNP/siHBVIL2）的構建和療效評價

本研究首先評價tLNP/siHBV在細胞小鼠模型中的抗病毒效果和生物安全性，結果顯示tLNP/siHBV未觸發細胞因子表達，測定肝內炎癥反應相關基因證實tLNP/siHBV的低免疫原性，在單次或多次（5次）給藥頻率下均呈劑量和時間依賴性，綜上tLNP/siHBV具有良好的靶向治療效果和安全性。基于以上結果，將siHBV與編碼小鼠白細胞介素-2（mIL-2）的mRNA共同封裝在tLNP中，以增加HBV特異性CD4+和CD8+T細胞反應頻率，打破免疫耐受，實現更好的病毒抗原抑制與免疫控制。

圖4 tLNP/siHBVIL2在小鼠模型中的抗病毒效果評價

結語

總之，本研究針對HBV全基因組篩選出多功能siRNA組合（siHBV），利用高效安全的tLNP的遞送系統實現siHBV和mIL-2 mRNA共遞送聯合療法，為進一步治療CHB提供一種可行的方法，也為LNPs遞送系統在核酸藥物治療領域的應用提供新的策略。