免疫療法刺激固有的免疫系統對抗惡性細胞徹底改變了臨床上的癌癥治療模式，已成為多種癌癥的標準治療方法。鑒于RNA可以通過抑制、增強、替代甚至編輯來調節基因表達，且mRNA和siRNA療法在癌癥免疫治療中展現出具有巨大潛力，因此RNA可以應用于沉默免疫檢查點基因、制造CAR-T細胞或者用作抗腫瘤疫苗等。然而，RNA療法在癌癥治療中的臨床應用受到RNA本身的不穩定性和各種生理屏障阻礙的限制。盡管存在這些挑戰，核酸藥物近年來獲得迅速的發展，特別是脂質納米顆粒（LNPs）在新型冠狀病毒COVID-19 疫苗的應用進一步增強了人們對RNA治療藥物在其他疾病治療應用的信心。

當下RNA介導的免疫療法仍然面臨著一些應用阻礙：1、LNPs主要在肝臟中積累并被肝細胞內化，從而限制了它們對其他器官和組織相關疾病的治療效用；2、LNPs存在穩定性問題，LNP需要超低溫儲存（例如BNT162b2：-60和-80 ℃；mRNA-1273：-15和-25 ℃），這對RNA藥物在全球運輸、儲存和流通是個極大的挑戰。因此，迫切需要探索替代策略以開發用于RNA遞送的臨床適用平臺技術。

2024年6月10日，華南理工大學生物醫學科學與工程學院王均教授團隊在材料科學領域國際刊物《Advance Functional Materials》上發表了題為“Long-Term Storage Stable Vesicle-Like Nanoparticles of Lipid and Polymer for siRNA and mRNA-Mediated Cancer Immunotherapy”的研究論交。第一作者：華南理工大學生物醫學科學與工程學院的博士研究生陳超然，通訊作者：華南理工大學生物醫學科學與工程學院許從飛教授、楊顯珠教授與王均教授。研究團隊通過使用臨床批準的材料兩親性聚合物PEG5K-b-PLGA11K、DLin-MC3-DMA和DOTAP，成功開發了用于siRNA和mRNA介導的癌癥免疫治療的VNP遞送平臺。篩選后的VNP體系的轉染效率與Lipofectamine RNAiMAX、LNP相當（圖1g）。此外，因為RNA被有效封裝在VNP的中空膠囊狀內核中，即使在6個月的儲存期（-20 ℃）后VNP也能保持優異的轉染效率（圖1hi）。

圖1 VNP-siRNA儲存穩定性研究

研究團隊還建立了小鼠黑素瘤治療模型和小鼠B16-OVA腫瘤預防模型，分別用以評估VNP介導siRNA和mRNA遞送的體內免疫治療效果。攜帶靶向PD-L1和CD47的siRNA的VNP能夠在小鼠皮下黑素瘤治療模型中增強腫瘤浸潤性CD8+ T細胞比例并改善巨噬細胞吞噬作用，從而表現良好的免疫治療效果（圖2ab）；攜帶表達OVA抗原mRNA的VNP疫苗在小鼠B16-OVA腫瘤預防模型中產生了強大的免疫效應抗原，在多組織中都檢測到了特異性CD8+ T細胞，可以有效抑制腫瘤生長（5/8小鼠出現完全緩解情況）和預防腫瘤肺轉移（幾乎100%）（圖2cdefg）。本研究開發出了具有優異的轉染效率以及較長的保質期的RNA遞送平臺技術VNP，為探索新型RNA遞送系統提供了簡便的策略。

圖2 VNP-RNA在腫瘤中的治療效果

附：VNP-siRNA的制備和表征

文中使用雙乳液法制備VNPs-RNA，其中兩親性 mPEG-b-PLGA、可電離脂質和陽離子脂質溶解在有機相中，而siRNA作為模型 RNA 藥物溶解在無 RNA 酶的水相中（圖3a）。為了確定用于RNA遞送的最佳VNP配方，初步研究了裝載效率與 DOTAP 和 DLin-MC3-DMA 的質量比之間的關系。結果表明，siRNA 的裝載效率高度依賴于 DOTAP 的含量，加入1.0 mg DOTAP 后達到98%，因此，配方中固定DOTAP 的質量為1.0 mg（圖3b）。隨后，研究了DLin-MC3-DMA 和 DOTAP 的質量比對 VNP-siRNA 性能的影響，結果表明，結構表明添加 DLin-MC3-DMA 對 siRNA 的裝載效率影響微乎其微，粒徑和 zeta 電位略有增加。此外，研究發現網格蛋白介導的內吞是 VNP-siRNA 的主要內化途徑，內吞程度與 MC3/DOTAP 的質量比直接相關，DLin-MC3-DMA 含量增加會導致細胞通過網格蛋白介導的內吞攝取減少（圖3j）。

對VNP進行體外篩選和體內生物分布研究。體外篩選結果表明，在不同腫瘤細胞類型中，MC3/DOTAP 質量比的增加有效地增強VNP對CD47 基因（在各種腫瘤細胞中高表達，可以逃避巨噬細胞的吞噬作用）的敲低效果，但不同細胞類型的最佳配方各不相同。體內生物分布研究結果表明，當 MC3/DOTAP 的質量比等于或小于1:1時，VNP 的腫瘤積累效果更好 (圖3f)。綜合考量，MC3/DOTAP 的質量比以1:1形成最終 VNP配方，用于后續涉及免疫檢查點基因沉默的抗癌研究。

圖3 VNP-siRNA的制備和表征

注：f：（I）Heart,（II）lung,（III）liver,（IV）kidney,（V）spleen,（VI）tumor.